Diagnosi eziologica di sepsi: valutazione di due test molecolari rapidi

Riassunto

Premesse.

La sepsi è un’infezione sistemica che nella medicina moderna risulta essere sempre più frequente e con un alto tasso di mortalità, soprattutto nei reparti di terapia intensiva, nonostante i progressi compiuti nella diagnosi e nel trattamento di tali infezioni. Una rapida ed accurata identificazione dei vari agenti patogeni isolati dal sangue è molto importante per un tempestivo intervento terapeutico; la somministrazione di una terapia antibiotica mirata è decisiva per ottenere una prognosi favorevole. Attualmente l’esame di laboratorio gold standard per la diagnosi di sepsi è l’emocoltura in quanto permette di determinare l’agente eziologico e la sua sensibilità agli antibiotici, informazioni utili al clinico per realizzare una terapia mirata. Il gold standard nella diagnosi delle infezioni ematiche purtroppo però permette di ottenere tutte le informazioni necessarie non prima di 36–96 ore, dopo che i flaconi di emocoltura sono pervenuti in laboratorio. Lo scopo di questo studio è stato valutare e confrontare, con il metodo tradizionale, due diversi metodi molecolari rapidi: un microarray (Verigene ^® Nanosphere, Inc., USA) ed un film-array (Film-Array ^® BioFire Diagnostics Inc., USA). Le due metodiche molecolari sono in grado, all’interno del loro pannello di microrganismi, di identificare il patogeno presente in un campione di emocoltura positiva e suoi determinanti di antibioticoresistenza.

Metodi.

Sono state analizzate in parallelo con le due metodiche molecolari microarray e film array un totale di 42 emocolture risultate positive nel sistema di monitoraggio continuo, comparando i risultati definitivi di identificazione e suscettibilità antibiotica generati per ogni campione dalle due tecniche molecolari e valutando la concordanza di questi risultati con il profilo di identificazione microbica e di antibiotico sensibilità ottenuti con il sistema utilizzato in routine MicroScan WalkAway ^® Siemens (Siemens Healthcare). Alla segnalazione di positività delle emocolture incubate nel sistema BD BACTEC™ FX (Becton Dickinson) un’aliquota di campione del flacone positivo è stata sottoposta alle indagini microbiologiche tradizionali (esame microscopico dopo colorazione di Gram, colture su piastra, identificazione degli isolati ed antibiogramma) ed in parallelo ai test diagnostici molecolari, microarray (Verigene ^® Nanosphere, Inc., USA) e film-array (FilmArray ^® BioFire Diagnostics Inc., USA).

Risultati.

Su un totale di 42 emocolture positive corrispondenti a 42 casi clinici differenti, il test molecolare Verigene ^® è stato in grado di identificare 44 agenti eziologici di sepsi (94%), mentre le metodiche tradizionali (coltura in piastra, identificazione biochimica, tipizzazione sierologica) ne hanno rilevati 47. L’analisi di emocolture positive per infezioni polimicrobiche miste (5 casi) ha determinato il numero maggiore di patogeni identificati dal sistema molecolare e dalla metodica tradizionale rispetto ai campioni effettivamente processati, ma è stata sempre rilevata una perfetta concordanza tra i risultati ottenuti con il test molecolare e quelli generati da piastra e da antibiogramma definitivo per quanto riguarda le resistenze associate ai patogeni identificati. Sono stati rilevate 9 positività per il gene di resistenza mecA, tutte associate a Staphylococci coagulasi negativi, come confermato dagli antibiogrammi diretti allestiti in piastra (100%). Non è stata invece rilevata alcuna positività per i geni vanA/vanB e KPC e gli antibiogrammi preliminari eseguiti per tutti i campioni analizzati hanno fornito il medesimo risultato.

Lo strumento Film-Array ^® è stato in grado di fornire risultati di identificazione microbica in 40 emocolture positive su 42 analizzate, mostrando una sensibilità del 95%. In soli due campioni analizzati il test molecolare non è stato in grado di rilevare alcun target batterico.

Conclusioni.

In questo studio è emerso che entrambi i metodi molecolari sono potenzialmente utili nel fornire una diagnosi di sepsi in tempi più rapidi rispetto al metodo di coltura tradizionale dopo la segnalazione di positività del flacone da parte del sistema a monitoraggio continuo per emocolture. Sono stati sviluppati diversi metodi per ridurre il turnaround time per l’identificazione degli agenti patogeni; la riduzione dei tempi di indagine può essere ottenuta utilizzando metodiche molecolari che possono essere eseguite sulle emocolture positive o direttamente su campioni di sangue.

Le nuove tecniche di diagnostica molecolare consentono al clinico di intraprendere precocemente una terapia antibiotica più mirata rispetto a quella a largo spettro e quindi fornire un notevole vantaggio nella gestione dei pazienti settici. L’opportunità di impostare il prima possibile una terapia mirata ed efficace rende possibile il contenimento e la riduzione di ceppi microbici multiresistenti ed inoltre permette una drastica diminuzione della spesa sanitaria associata a trattamenti terapeutici inappropriati con conseguenti tempi di degenza prolungati.

Summary

Background.

Sepsis currently is becoming more frequent and carries a high mortality rate, especially in intensive care units, despite the progress made in the diagnosis and treatment of such infections. A rapid and accurate identification of pathogens isolated from the blood is very important for a timely therapeutic intervention. The administration of a specific antibiotic therapy is decisive for obtaining a favorable prognosis. Actually the gold standard laboratory test for the diagnosis of sepsis is blood culture. Blood culture allows to determine the causative agent and its sensitivity to antibiotics, helping the clinician to achieve a targeted therapy. The gold standard in the diagnosis of bloodstream infections unfortunately gives results and informations not before 36–96 hours from the arrive in the laboratory.

The purpose of this study was to evaluate and compare with the traditional method, two different methods rapid molecular: a microarray Verigene ^® (Nanosphere, Inc., USA) and a film array (FilmArray ^® BioFire Diagnostics Inc., USA). The two molecular methods are able, within their panel of microorganisms, to identify the pathogen present in a sample of blood culture positive and its determinants of antibiotic resistance.

Methods.

Forty-two positive blood cultures were compared with two molecular methods microarray and film array. In the study the results of identification and antibiotic susceptibility for each sample generated by the two molecular techniques were correlated with the profile of microbial identification and antibiotic sensitivity obtained with the system used in routine MicroScan ^® WalkAway Siemens (Siemens Healthcare). The positive blood cultures incubated in the BD BACTEC ™ FX (Becton Dickinson) were subjected to conventional microbiological investigations (microscopic examination after Gram stain, culture plate, identification and susceptibility testing of isolates) and parallel to the molecular diagnostic tests, microarray (Verigene ^® Nanosphere, Inc., USA) and film array (FilmArray ^®) BIOFIRE Diagnostics Inc., USA).

Results.

This study showed that both molecular methods are potentially useful in providing a rapid diagnosis of sepsis. Several methods have been developed to reduce the turnaround time for the identification of pathogens but only molecular methods, that can be performed directly on positive blood cultures reduce the time of investigation and allow numerous advantages.

Conclusions.

The new molecular diagnostic techniques allow the clinician to undertake early antibiotic therapy more targeted than broad-spectrum and thus provide a considerable advantage in the management of septic patients. The opportunity to set up as soon as possible a targeted therapy makes it possible the reduction of multidrug-resistant microbial strains and also allows a drastic reduction of health care costs associated with inappropriate treatments and prolonged hospital stay.