T/A-Cloning

Zusammenfassung

Das T/A-Cloning basiert auf der Fähigkeit vieler thermostabiler DNA-Polymerasen an jedes 3′-Ende eines synthetisierten PCR-Fragmentes ein einzelnes überhängendes Nucleotid anzufügen (3′-Adenylierungsaktivität) (Abb. 6.1) (Clarke et al. 1988). Präferentiell wird ein Adenosin-Nucleotid eingefügt, aber es können auch bei geringer dATP-Konzentration alle weiteren Nucleotide herangezogen werden.

Alle PCR-Fragmente mit einem A-Überhang lassen sich in einen linearisierten T-Überhang Vektor relativ leicht und ohne vorherige enzymatische Behandlung (z. B. Restriktionsverdau) ligieren (Abb. 6.2), weshalb das T/A-Cloning eine schnellere und einfachere Methode gegenüber dem Restriktionsverdau sowie Blunt-end-Ligationen darstellt (Zhou et al. 1995). Zudem müssen keine speziell modifizierten Oligonucleotide konstruiert werden. Allerdings ist eine richtungsorientierte Klonierung nicht möglich, und es ist essentiell, dass die PCR-Fragmente unmittelbar nach der PCR für das T/A-Cloning eingesetzt werden, da eine Lagerung bei unterschiedlichen Temperaturen für mehrere Stunden eine Degradation des A-Überhanges verursacht. Dieses hat die Auswirkung, dass die Ligationseffizienz dramatisch reduziert wird.

Kommerziell können verschiedene T/A-Cloning Kits von z. B. Life Technologies, New England Biolab und Promega erworben werden. Generell kann aber fast jede thermostabile DNA-Polymerase mit den üblichen PCR-Parametern eingesetzt werden (Tab. 6.1).